The Role of Microenviroment in Glioblastoma Progression and Resistance Development

El glioblastoma (GBM) es un tumor cerebral primario altamente heterogéneo, con una tasa de supervivencia muy baja. Recientemente se ha demostrado que su microentorno tumoral complejo tiene un papel esencial en la progresión del tumor y la respuesta a la terapia. Por lo tanto, es crucial identificar todos los componentes y sus interacciones, e incorporarlos en modelos in vitro utilizados para estudios sobre GBM y el desarrollo de nuevas terapias. El desarrollo de nuevas tecnologías en las últimas décadas ha asegurado el progreso en ambos campos mencionados. Diferentes técnicas multiómicas permiten una caracterización detallada de las muestras de los pacientes. Por otro lado, la evolución de las técnicas de cultivo celular y los procesos de fabricación permiten la creación de sistemas in vitro más fisiológicos que el cultivo tradicional en placas de Petri (organ on chip). El principal objetivo de esta tesis fue estudiar el papel del microentorno en la respuesta del GBM al tratamiento con temozolomida (TMZ). Se modificaron dispositivos microfluídicos, desarrollados previamente dentro del grupo, para estudiar el impacto de la concentración de oxígeno en la progresión de GBM. Se demostró que la hipoxia es esencial para la formación del núcleo necrótico y protege a las células del efecto de TMZ. Además, se mejoró el diseño del dispositivo microfluídico para permitir la creación de un sistema más avanzado y controlable. Igualmente, el cultivo de esferoides nos proporcionó un modelo valioso para los estudios de desarrollo de quimio-resistencia. Tras la aplicación de dos ciclos de tratamiento clínico con TMZ, se observó la aparición de una población de esferoides resistentes. Morfológicamente, esos esferoides eran una combinación de esferoides control y esferoides tratados, que tenían un patrón de expresión génica específico. Por último, se utilizó una nueva técnica de transcriptómica espacial para caracterizar mejor las muestras de pacientes con GBM, correlacionando su expresión génica con la ubicación histológica. Esto permitió la identificación de clusters transcriptómicos diferenciales dentro de tejidos aparentemente homogéneos, confirmando la alta heterogeneidad de este tumor, no solo en el aspecto morfológico sino también molecular. Glioblastoma (GBM) is a highly heterogeneous primary brain tumor, with a very low survival rate. It has been shown recently that the complex tumor microenvironment has an essential role in tumor progression and therapy response. Hence, it is crucial to identify all the components and their interactions, and incorporate them in in vitro models used for GBM studies and therapy development. The development of new technologies in the last decades ensured progress in both mentioned fields. Different multiomics techniques allow detailed characterization of the patient samples. On the other hand, the evolution of cell culture techniques and fabrication processes enables the creation of more physiological in vitro systems than traditional Petri dish culture (organ on chip). The main aim of this thesis was to study the role of the microenvironment in the response of GBM to temozolomide (TMZ) treatment. Microfluidic devices, previously developed within the group, were modified to study the impact of oxygen concentration on GBM progression. Hypoxia was shown to be essential for the necrotic core formation and it protected cells from the TMZ effect. Moreover, the microfluidic device design was improved to enable the creation of a more advanced and controllable system. Furthermore, spheroid culture gave us a valuable model for chemoresistance development studies. After the application of two clinical TMZ treatment cycles, the presence of a population of resistant spheroids was observed. Morphologically, those spheroids were a combination of control and treated spheroids, and they had a specific gene expression pattern. Last but not least, a new spatial transcriptomics technique was used to characterize better GBM patient samples correlating their gene expression with the histological location. It enabled the identification of differential transcriptomic clusters within apparently homogeneous tissues, confirming the high heterogeneity of this tumor, not only in a morphological aspect but also molecularly.<br /

Zonación hepática y su asociación con la patología metabólica

El hígado es un órgano con múltiples funciones, las cuales son necesarias para el metabolismo y la homeostasis de todo el organismo. Aunque se ha considerado un órgano homogéneo en su estructura, en realidad presenta una organización funcional que depende de la localización de los hepatocitos a lo largo del sinusoide. Es lo que se conoce como zonación hepática. Muchas de las funciones del hígado presentan zonación, como los metabolismos glucídico y lipídico, el metabolismo proteico y la eliminación del amonio, la síntesis de bilis o la eliminación de xenobióticos. En este trabajo nos centraremos en la zonación del metabolismo, su regulación a través de vías de señalización y gradientes de oxígeno, hormonas o sustratos, su importancia en la fisiología hepática y su implicación en la patología metabólica, fundamentalmente en la esteatosis no alcohólica y en la resistencia a la insulina

Inmunoterapia en cáncer colorrectal

El objetivo de la inmunoterapia es mejorar la respuesta inmune ante las enfermedades. Desde hace décadas se investiga en distintos tratamientos inmunoterápicos para su aplicación en cáncer pero su éxito ha llegado sólo hace muy poco tiempo. Es por ello que está por venir una época donde se van a desarrollar una gran cantidad de alternativas terapéuticas como los inhibidores de checkpoint, vacunas antitumorales, la terapia adoptiva de células T o la creación de virus oncolíticos que combinados con las terapias empleadas actualmente como la cirugía, quimioterapia o radioterapia den resultados exitosos de cara a la lucha contra el cáncer. Dado que el cáncer colorrectal es causa de un elevado número de muertes a nivel mundial y que estos tumores han demostrado respuesta a tratamientos inmunoterápicos se antoja crucial el desarrollo de distintas estrategias inmunoterápicas para disminuir tanto la incidencia como el número de decesos causados por dicha enfermedad. Actualmente en las primeras fases de la enfermedad se requiere de cirugía puesto que la inmunoterapia aún no ha demostrado eficacia en estas fases. Por ello la inmunoterapia en cáncer colorrectal va dirigida a estadios donde la enfermedad se encuentra ya diseminada y las terapias convencionales no son capaces de actuar.<br /

PAPEL DE LOS FIBROBLASTOS ASOCIADOS AL CÁNCER EN LA PROGRESIÓN Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER DE COLON

El cáncer colorrectal es uno de los tumores malignos más prevalentes y mortales en los países occidentales. Y a pesar de que recientes mejoras en la cirugía y la quimioterapia han aumentado la supervivencia de estos pacientes, la tasa global de supervivencia a los 5 años es del 64,3%, mientras que la de los pacientes con estadios más avanzados es sólo de un 11,7%. Estos datos hacen necesario el desarrollo de nuevas estrategias, y la participación del microentorno tumoral en el desarrollo de resistencias ha adquirido una gran importancia en los últimos años. La progresión tumoral y posterior invasión metastásica requieren la conjunta evolución de las células tumorales con el microentorno, el cual está formado por múltiples elementos como células no transformadas, matriz extracelular modificada, una mayor densidad de vasos, células inflamatorias y del sistema inmune y fibroblastos con un fenotipo "activado", los denominados fibroblastos asociados al cáncer o CAFs, de manera que todos ellos participan activamente. Estos CAFs tienen un origen heterogéneo y todavía no bien descrito, ya que pueden provenir de fibroblastos normales que se han transformado por la acción de moléculas exógenas o alteraciones genéticas; de las células endoteliales a través de una transdiferenciación; de las propias células epiteliales tumorales a través de una transición epitelio-mesenquimal; o de las células mesenquimales procedentes de la médula ósea. Pero todavía no se conoce con certeza. Y aunque sus mecanismos de acción aún no son del todo conocidos, cada vez se sabe un poco más. Además de actuar de diferentes formas, lo hacen con diferentes fines, es decir, no sólo promueven el crecimiento del tumor, sino que también facilitan la invasión de las estructuras vecinas, favoreciendo la producción de metástasis, todo ello mediante la secreción de diferentes factores como el factor de crecimiento transformado beta (TGF-β), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) o citoquinas inflamatorias, interviniendo en sus vías metabólicas, modificando la composición de la matriz extracelular, e incluso de manera indirecta, promoviendo la angiogénesis, la inmunosupresión o el desarrollo de nichos que dificulten la llegada de los fármacos. Por eso, el futuro se halla en la investigación de los CAFs y el desarrollo de nuevas estrategias frente a alguna de sus múltiples formas de participar en la tumorogénesis, en cualquier etapa del proceso

Development of microfluidic tools to reproduce and characterize the tumor microenvironment

A pesar de que la incidencia del cáncer está en aumento, sobre todo en los países desarrollados, el desarrollo de nuevos fármacos contra esta enfermedad es cada vez menos efectivo. Para revertir esta tendencia, aparece la necesidad de desarrollar mejores herramientas para reproducir y caracterizar el microentorno tumoral. Una de ellas son modelos in vitro más precisos.En este contexto, la microfluídica se presenta como una potente alternativa para el desarrollo de estos nuevos modelos in vitro más precisos, que puedan emplearse para un desarrollo y selección de fármacos más racional y efectivo. No obstante, se trata de un conjunto de técnicas poco extendido en los laboratorios de biología molecular. Así, en la presente tesis se desarrollan dos modelos microfluídicos del microentorno tumoral para tumores sólidos, junto a las herramientas necesarias para su caracterización, todo ello de fácil uso para tratar de generalizar la aplicación de los mismos.En el capítulo 1 se realiza una revisión del estado de la cuestión en lo referente a modelos de cáncer in vitro y su caracterización. En el capítulo 2 se desarrolla un modelo microfluídico de co-cultivo que permite estudiar las interacciones endotelio-tumor, así como la capacidad de penetración y erradicación de células tumorales de nuevos fármacos. En el capítulo 3 se presenta una herramienta para caracterizar los niveles de oxígeno molecular en cualquier punto de un cultivo in vitro 3D. En el capítulo 4 se presenta un modelo de tumor centrado en la generación y caracterización de gradientes biológicos, así como su adaptación a las técnicas tradicionales de biología molecular para el análisis del perfil genético del microentorno tumoral a lo largo del tiempo. Para generar los sistemas microfluídicos descritos anteriormente, se emplearon dispositivos fabricados mediante distintas técnicas y materiales. En los dispositivos se sembraron distintas poblaciones celulares, intentando así reproducir la estructura y organización de los tejidos biológicos. Mediante diferentes técnicas de microscopía (óptica, fluorescencia, confocal, imagen en tiempo real) y sondas fluorescentes se monitorizó la evolución y comportamiento celular. La caracterización del hidrogel sensible al oxígeno se realizó a través de las técnicas ya citadas, así como espectrofotometría, microscopía de fuerza atómica y electrónica de barrido en condiciones ambientales. Finalmente, la extracción de las células de los hidrogeles se realizó por medio de degradaciones enzimáticas, y la cuantificación de la expresión génica mediante extracción de RNA, retrotranscripción y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa.La conclusión general de la tesis, es que la utilización de modelos biomiméticos cambia dramáticamente el resultado de los ensayos realizados in vitro, por lo que su uso es necesario para obtener resultados relevantes y trasladables a la clínica. Asimismo, el desarrollo de sistemas biomiméticos in vitro del microentorno tumoral de uso generalizado es posible mediante el desarrollo de dispositivos de fácil uso, así como del establecimiento de métodos robustos de caracterización de los mismos, tanto in situ como “aguas abajo” del establecimiento de los modelos. Bibliografía: 1. Balkwill FR, Capasso M, Hagemann T (2012) The tumor microenvironment at a glance. J Cell Sci 125: 5591-5596.2. Junttila MR, de Sauvage FJ (2013) Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature 501: 346-354.3. Scannell JW, Blanckley A, Boldon H, Warrington B (2012) Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nat Rev Drug Discov 11: 191-200.4. Adriani G, Pavesi A, Tan AT, Bertoletti A, Thiery JP, et al. (2016) Microfluidic models for adoptive cell-mediated cancer immunotherapies. Drug Discov Today 21: 1472-1478.5. Ayuso JM, Virumbrales-Munoz M, Lacueva A, Lanuza PM, Checa-Chavarria E, et al. (2016) Development and characterization of a microfluidic model of the tumour microenvironment. Sci Rep 6: 36086.6. Ayuso JM, Monge R, Martínez-González A, Virumbrales-Muñoz M, Llamazares GA, et al. (2017) Glioblastoma on a microfluidic chip: Generating pseudopalisades and enhancing aggressiveness through blood vessel obstruction events. Neuro-Oncology: now230.<br /

Development and application of microtechnologies in the design and fabrication of cell culture biomimetic systems

“Lab-On-a-chip” systems have proved to be a promising tool in the field of biology. Currently, cell culture is performed massively on Petri dishes, which have traditionally been used in cell culture laboratories and tissue engineering. However, having proved to be a widely used tool until now, the scientific community has largely described the lack of correlation between the results obtained in the laboratory and the clinical results. This lack of connection between what has been studied in the laboratories and what has been observed in the clinic has led to the search for more advanced alternative tools that allow results to be obtained closer to reality. Thus, the use of microtechnologies in the field of biomedical engineering, presents itself as the perfect tool as an alternative to obsolete traditional media. Thanks to the low volumes of liquid it presents for its use, it also makes it an essential technology for the testing of drugs, new compounds and materials. By being able to more accurately reproduce the biomimetic environment of cell cultures and tissues, they make this technique fundamental as an intermediate step between basic in vitro laboratory tests and preclinical animal tests, resulting from this way in the best alternative for the reduction of both the use of animal models, as in times and costs. For a biomimetic system to be as such, it also needs another series of complementary devices for its better functioning. Micro-valves, micro pumps, flow sensors, O2 sensors, pH, CO2 are fundamental for the correct functioning andsophistication of biomimetic systems. This complexity, on the other hand, is often not perceived by the user since the miniaturization of all these components makes “Lab-On-a-Chip” systems smaller every day, despite numerous control components that can be incorporated.This thesis presents some examples of different microfluidic devices designed and manufactured through the use of microtechnologies, with all applications, focused on their use in biomimetic systems.<br /

Caracterización de biomateriales compuestos para su uso en ingeniería de tejidos

La artrosis es una enfermedad degenerativa de las articulaciones que produce el desgaste del cartílago originando dolor, rigidez e incapacidad funcional. En la actualidad, los tratamientos aplicados se centran en paliar sus efectos. Sin embargo no existen recursos eficaces para evitar su aparición, ni métodos para detener el proceso degenerativo. Las investigaciones actuales se encaminan al desarrollo de técnicas capaces de regenerar la estructura y el funcionamiento del tejido lesionado. Una de las ideas que está adquiriendo mayor importancia es el uso de implantes de células madre mesenquimales embebidas en matrices o andamios tridimensionales. Dichos andamios tienen como objetivo principal aportar el soporte estructural y facilitar la adhesión, proliferación y migración de las células, logrando así la regeneración tisular. Los hidrogeles son biomateriales que, debido a su elevada capacidad de absorción de agua y la gran similitud con el microambiente celular están demostrando ser particularmente útiles en el diseño y fabricación de andamios. Permiten la difusión de nutrientes y oxígeno a las células, así como la eliminación del dióxido de carbono y productos de desecho del interior del andamiaje. Sin embargo, quedan por estudiar aspectos fundamentales relacionados en gran medida con las propiedades macroscópicas de los mismos. En particular estudios de las cargas que soportan, las velocidades de los flujos a través del material poroso, la permeabilidad, etc. Por lo tanto, es necesario conocer en profundidad cómo afectan dichas variables al comportamiento del hidrogel. Como objetivo principal de este proyecto se propuso caracterizar mecánicamente un nuevo material fabricado a base de hidrogel. Este biomaterial pretende mimetizar al cartílago articular humano para poder ser utilizado en un biorreactor en Ingeniería de Tejidos. Para ello se realizó el estudio de varias familias de andamios estructurales compuestos, en diferentes proporciones, a base de poly(ethyl acrylate) (PEA) que actúa como red de refuerzo y poly(hydroxyethyl acrylate) (PHEA) que es propiamente el hidrogel. Se analizó en detalle el proceso de síntesis, se caracterizó mecánicamente el material a nivel macro y micro-estructural y se determinó qué familia de material presentaba un comportamiento más semejante al del cartílago articular humano

Uso de plataformas microfluídicas para la valoración de drogas anti-tumorales

La nueva formulación de TRAIL basada en su asociación a vesículas lipídicas de tipo LUV (Large Unilamellar Vesicles) denominada LUV-TRAIL ha aumentado la capacidad citotóxica de TRAIL frente a distintas células tumorales. En este trabajo se ha comparado la citotoxicidad de TRAIL soluble y LUV-TRAIL en líneas celulares tumorales de pulmón (A549) y de riñón (Caki-1). La citotoxicidad ha sido estudiada tanto mediante cultivos celulares convencionales como mediante cultivos tridimensionales empleando plataformas microfluídicas. Los resultados obtenidos en ambos tipos de cultivos celulares muestran que los LUV-TRAIL presentan una mayor capacidad citotóxica que TRAIL soluble validando esta nueva formulación de este ligando mortal y demostrando que el empleo de plataformas microfluídicas puede ser muy útil en el estudio de diferentes compuestos anti-tumorales ya que permiten crear in vitro modelos tumorales que se asemejan a las condiciones in vivo sin el uso de animales de experimentación

PUESTA EN MARCHA DE UN MODELO IN VITRO 3D DE EPITELIO INTESTINAL COMO BASE DE UN MODELO DE CÁNCER DE COLON EN CHIP

El cáncer de colon es un problema relevante para la salud pública, con una incidencia y una mortalidad elevada en todo el mundo. El desarrollo de nuevos modelos de estudio in vitro ha permitido superar importantes desventajas de modelos anteriores. Entre estos modelos se incluyen los modelos 3D de Organ-On-Chip. El objetivo del presente estudio fue recrear in vitro el epitelio de colon en un dispositivo microfluídico. En dicho modelo las células epiteliales se adhieren a una membrana porosa, que las separa a su vez de un canal inferior. El modelo será la base para el desarrollo posterior de un modelo Organ-On-Chip de cáncer de colon. Para ello se sembraron células Caco-2 o Caco-2:HT29-MTX (a un ratio 3:1, similar al ratio enterocitos:células caliciformes de colon) que se dejaron diferenciar durante 21 días. Sobre el modelo se valoró la diferenciación celular, la integridad del epitelio, la producción de moco y la evolución del epitelio en el tiempo. Se estableció una monocapa tanto con las células Caco-2 como Caco-2:HT29-MTX, que se mantuvo en cultivo durante 21 días. Las pruebas de azul alcián y de inmunofluorescencia para Muc-2 mostraron producción de mucina por las células HT29-MTX a 7 y 21 días, respectivamente. La permeabilidad del epitelio, mediante la técnica de Lucifer Yellow, similar a la observada en intestino y estudios previos, fue ligeramente mayor en las células Caco-2 con HT29-MTX, aunque no significativamente. Los resultados indican la formación de un epitelio similar al del colon, con una permeabilidad parecida y secreción de moco, si bien serán necesarios futuros estudios para una mejor caracterización. <br /

Desarrollo de un modelo biomimético in vitro de metástasis de cáncer de mama basado en tecnología Organ-on-Chip

Una de las principales dificultades a la hora de estudiar el cáncer de mama, y especialmente el proceso de metástasis, es la ausencia de modelos que representen fielmente las características del tumor.La tecnología microfluídica, u “on-chip” se presenta como una alternativa prometedora, ya que permite generar estructuras tridimensionales de células, que pueden combinarse con un fluido o incluso con células no tumorales, de forma que se emula de una forma más completa el entorno del tumor, que es un factor crucial en el desarrollo del mismo.En este proyecto se optimizarán los procedimientos de generación de esferoides con dos líneas celulares de cáncer de mama: MDA-MB-231, un tipo de células cancerosas agresivas y con gran capacidad para generar metástasis; y MCF-7, sin capacidad de migración.Tras su obtención, se evaluará el crecimiento de los mismos, y se observará su comportamiento tras ser transferidos a una matriz de colágeno.Además, en el caso de las células MDA-MB-231, se estudiará su migración tanto en placa de pocillos como en chip.<br /